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5XHotStart HiFi G5 PCR Mix(with Dye)

產品編號 產品名稱 規格 價格(元) 說明書
A0605A 5XHotStart HiFi G5 PCR Mix(with Dye) 40T×50μl體系 250
A0605B 200T×50μl體系 1000
G5 超保真DNA聚合酶(性能等同于NEB Q5超保真DNA聚合酶)來源于高保真Pfu DNA聚合酶,具有很強的3’-5’外切酶活性。經基因工程改造后,其具有100倍于Taq DNA聚合酶的保真能力,此外其還具有6kb/min的延伸速度。擴增能力強、保真性高,可用于載體構建、突變修復、基因合成、DNA測序等對保真性能要求較高的試驗。該酶的擴增產物為平端產物,不含“A”尾。該酶以λDNA為模板擴增20kb基因片段,以人基因組為模板擴增12kb的基因片段。
5XHotStart HiFi G5 PCR Mix(性能等同于NEB Q5熱啟動超保真PCR Mix)是經優化的即用型PCR預混物,含有經抗體封閉的熱啟動G5 超保真DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應緩沖液、PCR增強劑和穩定劑,使用時只需加入模板、引物和滅菌水即可進行PCR擴增,大大簡化了操作過程、提高了效率、減少了PCR操作過程中的人為誤差。具有快速簡便、重復性高、特異性好、靈敏度高和穩定性好的特點。該制品中已經含有溴酚藍染料,PCR擴增完畢后可直接點樣于瓊脂糖凝膠,無需再加入DNA Loading Buffer。

組份

名稱 40T(50μl體系) 200T(50μl體系)
5XHotStart HiFi G5 PCR Mix(with Dye) 0.4 ml 0.4 ml x5

主要特征

  • 具有100倍于Taq DNA聚合酶的保真能力。
  • 頂級的擴增速度,在目的條帶≤2kb時擴增速度可達4kb/min以上。
  • 具有良好的模板兼容性,對于基因組、質粒、cDNA、λDNA模板都有良好的擴增。
  • 優異的長片段擴增能力,以λDNA為模板可擴增20kb產物。
  • 良好的擴增靈敏度,人基因模板低至1ng也可以有效擴增。
  • 應用

    基因合成、突變修復和平端克隆。

    儲存

    長期儲存置于-20°C以下,可保存2年,避免反復凍融;短期使用置于4°C(3個月)保存,一經融化后請放置于4°C,勿再凍存。

    實例

    1. 良好的模板兼容性和長片段擴增
    使用5XHotStart HiFi G5 PCR Mix以 Gdna(A)、λDNA(B)、Hela Cdna(C)為模板擴增不同靶基因,結果顯示5XHotStart HiFi G5 PCR Mix具有優異的長片段擴增能力,基因組可達12kb以上、λDNA可達20kb以上、Hela cDNA可擴增至7.6kb以上。 A: 1~5 分別為以gDNA為模板擴增的500bp、2kb、5kb、8kb、12kb PCR產物; B: 1~7 分別為以λDNA為模板擴增的 500bp、1kb、2kb、5kb、8kb、15kb、20kb PCR產物; C:1~8分別為以cDNA為模板擴增的166bp、552bp、960bp、1574bp、1705bp、2755bp、4128bp、7600bp PCR產物。M:Marker 10000。
    基因名稱 模板使用量
    gDNA:500bp、2kb、5kb、8kb、12kb ≤2kb 50ng
    2kb~8kb 100ng
    >8kb 200ng
    λDNA:500bp、1kb、2kb、5kb、8kb、15kb、20kb 50 ng
    Hela cDNA:166bp、552bp、1574bp、1705bp、2755bp、4128bp ≤2kb 相當mRNA 50ng
    >2kb 相當mRNA 200ng

    ≤2kb

    2~8 kb

    ≥ 8 kb

    95°C,2min

    95°C,2min

    95°C,2min

    95°C,20s

    58°C,20s

    72°C,30s32cycles

    95°C,20s

    58°C,20s

    72°C, 2kb/min 32cycles

    95°C,20s

    58°C,20s

    72°C, 1kb/min 32cycles

    72°C,2min

    72°C,2min

    72°C,2min

    高保真PCR Mix
    2.不同延伸速度對于擴增的影響
    使用5XHotStart HiFi G5 PCR Mix,以gDNA為模板擴增2259bp(A)和4564bp(B)目的片段,分別用不同的延伸時間,結果表明當目的片段長度≤2259 bp時G5 PCR Mix的延伸速度在4kb/min以上,而片段長度≥4564bp時延伸速度為2kb/min。A圖1-4延伸時間分別為10s、30s、1min、2min,B圖5-8同A圖1-4;M: DNA Marker 10000。
    高保真PCR Mix
    3. 擴增靈敏度測試
    使用5XHotStart HiFi G5 PCR Mix,以gDNA為模板擴增2259bp目的片段,設置不同的模板梯度,結果表明基因模板低至1ng 時G5 PCR Mix也可以有效擴增。圖中1-10模板量分別為0.5ng、1ng、5ng、10ng、25ng、50ng、100ng、200ng、0.5μg、1μg;M: DNA Marker 10000。
    高保真PCR Mix

    常見問題及解決方案:

    無擴增或產量低 循環數
    退火溫度
    模板DNA純度和用量
    延伸時間
    引物用量
    引物設計
    增加循環數至35~40cycles
    以2℃為單位降低退火溫度
    使用高純度的模板DNA,使用合適的模板量。
    延伸時間按1 kb/min設置
    在0.1μM~0.5μM之間選取合適的引物量
    重新設計優化引物
    出現雜帶或Smear 退火溫度
    引物濃度
    循環數
    模板DNA使用量
    引物

    以2℃為單位提高退火溫度
    降低引物濃度至0.2μM
    降低循環數至25~28cycles
    使用合適的模板量,不要過多使用
    重新設計優化引物

     
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